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周围朋友经常会来问我关于手持式基因枪的问题，因为我恰好对GDS-80和Helios这两款产品都还相当熟悉，而且还算是比较有研究，但是疲于口头应答，所以希望把我的经验以文字的形式整理出来，方便更多的朋友参考。 首先一点开宗明义，基因枪不是市面上经常见到的普通生命科学仪器，没有什么很多花里胡哨的旁枝末节的细节仪器参数可以比较，全世界只有两个公司有能力研发制造这种设备，一个是美国WEALTEC(威泰克)公司，一个是美国BIORAD(伯乐)公司。而这两款产品的工作原理截然不同，除了都是用于外源基因加速投递的这个基本功能用途一致之外，其他各方面产品构造几乎完全不同。简单来说，如果经费充裕，请毫不犹豫选择威泰克公司的GDS-80基因枪，因为从各方面性能比较来看，毫无疑问第三代低压手持式基因枪不论在性能、转化效率、还是易用性以及使用成本方面，优势都是显而易见的，用过之后无法回头再用其他基因枪。但如果咱们课题组预算非常吃紧，但是又急需添加一台快速基因导入装置，远水解不了近渴，有总比没有强，上Helios，但是确保要求厂商包培训，最好谈好后续上门培训收费，并且签署商用授权免责协议，为什么?这是经验，后面再讲。 Helios基因枪普遍被认为是第一代台式基因枪和第三代低压手持式基因枪的第二代过渡产品。为什么这么说?Helios的诞生，是因为第一代高压台式基因枪PDS-1000最初开发的背景，是实验室需要一款快速基因投递工具用于植物类实验。台式PDS-1000基因枪，是通过高压震波原理，在一个狭小密闭空间内的真空环境下轰击小块植物样品，比如愈伤组织或洋葱表皮。而这种环境下，是无法做动物类转化应用的，其原因如下： 第一，因为没有植物细胞的细胞壁保护，动物细胞在真空环境中很容易大量破裂死亡;第二，台式基因枪轰击时，是密闭空间轰击，无法用人手固定小动物，并且高压震波会对活体动物，造成直接杀伤;第三，台式基因枪轰击面积大，不能精确投递到，比如小鼠腹部这种局部区域，大量子弹偏离靶点无法发挥作用;第四，对于兔子等稍大型动物的外源基因投递，台式枪的轰击室装不进去。 所以Helios基因枪主要是为了解决动物实验的问题，专门开发出来的一款动物用基因枪。通过基因枪法对小动物进行外源基因投递，与传统的针头注射或者电转化技术相比，粒子轰击可以实现许多优势。首先，动物基因枪可用于将基因直接转移到各类型的动物细胞中，与细胞类型，配体/受体和细胞表面标志物或分子无关。第二，基因枪法可以克服物理障碍，例如细胞壁和表皮角质层，从而有效地将基因传递到细胞中。第三，通过基因枪的高速轰击投递，DNA质粒会更容易地被打入到细胞内，而不是细胞间质。 Helios基因枪同样是靠高压震波投递，但是因为在小动物实验中，需要较高的投递区域精确性，以及更高的轰击密度，因此并无法沿用破裂膜、载体膜和阻挡网的这种粗线条轰击模式。因为PDS-1000台式基因枪的逻辑是，同样是10微升的金粉微载体，我平铺到一块稍大面积的载体膜上，然后通过高压震波，把载体膜猛推到下方阻挡网上，让金粉微载体通过阻挡网间隙，被甩到下方样品上做轰击。因为小块植物样品，我可以多铺一些，人为增加被轰击样品的表面积，增加转化概率。但是小动物身体本来就很小，尤其是小鼠腹部区域，如果还想继续沿用PDS-1000基因枪同样的轰击逻辑，那就只能改为采用很小的一片载体膜来涂抹微载体，再配合用很小的一块阻挡网来轰击，而很小面积的载体膜，承载的金粉微载体量就会很少，再加上阻挡网会被动阻挡消耗约50%的微载体，如果真的采用这种设计，转化效率就会变得非常非常低。 于是Helios这款产品采用的策略是，从纵深角度优化，使用圆柱形结构的“载体膜”，通过内壁纵深表面积的增加，来提高金粉微载体的载量。也就是用Tefzel管，通过一定的工艺，让管子内粘附上金粉微载体，作为“子弹”，然后用高压氦气震波冲过Tefzel管子，把管内壁“粘附”着的“子弹”吹出枪管。 这里的Tefzel管就起到了类似PDS-1000台式枪里面载体膜的作用。但这又恰恰带来了下一个问题，那就是，我们知道载体膜是平的，很容易涂抹上去，那Tefzel管直径只有几毫米，怎么才能把金粉溶液均匀地粘附到这么细的管壁上呢?要知道，随便涂一涂肯定是不行的，因为不均匀涂抹意味着每发子弹都是不均匀的微载体分布，也就意味着每次基因枪的轰击量都会随机变化，无法人为进行控制，也就意味着实验结果无法重现。 于是非常逆天的样品管制备站就出现了。随Helios主机配套的，还有一个大家伙，那就是样品管制备站。之前为什么说一定要包培训?以及为什么要谈好后续上门培训的费用?就是因为用样品管制备站做子弹，是一个噩梦般的专业技术活，厂家工程师手把手教会一个人，还需要大约半个月到一个月的实际操作训练，熟悉每个步骤的顺序，以及各个环节背后的原理，才能熟练把仪器操作起来。 那究竟我们如何用样品管制备站制备子弹呢? 首先，检查样品管制备站各部件安装就位，各管路连接通畅，这步按照说明书逐个部件进行核对即可，这个不难，但需要耐心和细心。然后，在真正制弹之前，这里你需要做一个手法练习：用注射器缓慢匀速地从Tefzel管中抽液体出来，而且这步很重要。因为制弹时，我们需要先用注射器连接Tefzel管，将金粉溶液“吸”到管中，然后将Tefzel软管插入制备站的旋转轴中间，等金粉沉降之后，慢慢地把管内的乙醇溶液吸走，这样才能只留下金粉在管子内部，进行后续的管壁镀金。而这个环节，需要配合计时器，练习用手拉注射器的速度。理想的速度是0.5–1.0英寸/秒或0.06–0.12毫升/秒或3.6–7.2毫升/分钟，过快或者过慢都会影响制弹的品质。具体如何练习呢?方法是切割一根约30英寸的管子，装入约3.0毫升的乙醇(～24英寸或~60厘米的管长)，在多个点上标记管子，并使用以秒为单位测量时间的计时器练习，从整个管道中抽出液体需要25-45秒，并且安装拆卸管子时，应快速熟练，减少中间过程消耗的时间，尽量避免中间过程金粉沉降带来的不均匀问题。 如果拉拽过快，抽吸过程中产生的涡流，会把本来已经沉降的金粉重新卷起来，被动地随着乙醇溶液重新被抽走浪费掉。如果拉拽过慢，还没等后半段液体被抽走，前半段沉降在管壁下方的金粉，就会抢先开始结块干燥了，没法进行后续的混匀。 所以，你需要在正式制弹之前，先修炼“内功”，把拉注射器的速度先练习好! 因为Helios基因枪子弹制备原理，是需要让金粉“粘附”在Tefzel管壁上的。因此，与其他基因枪的金粉溶液配制不同，Helios制弹时，需要加一剂额外的配方：PVP(Polyvinylpyrrolidone 聚乙烯聚吡咯烷酮)。PVP在用Tefzel管制弹过程中，充当着粘合剂的作用，否则金粉无法均匀地粘附在管内壁。但是PVP的最佳用量必须根据经验确定，典型的PVP浓度范围是0.01至0.1 mg/ml。过高的PVP浓度，会导致金粉附着的太强，而无法被氦气从管壁上带下来，真正打到样品上。但是如果PVP浓度过低，这会导致金粉无法有力的附着在管壁上，而是半粘连半悬浮的挂在管壁上，这时候，当高压氦气震波通过Tefzel管时，金粉微粒无法获得PVP粘附突然断裂带来的向外的径直冲力，反而会跟随震波无序扰动被推出枪膛，不能造成有效的穿透轰击，而是大量残留在样品表面。 另外，使用PVP作为粘合剂需要确保100%无水环境，配置溶液时需要确保使用100%无水乙醇，如果溶液中有水分需要先除水。并且Tefzel管内壁也需要准备额外的氮气进行预干燥。氮气预干燥时，麻省大学医学院(university of massachusettsat worcester)在发表的一篇文章中建议，需要将Tefzel管道插入样品管制备站，使用在〜0.2 lpm(升/分钟)的氮气，下干燥过夜。干燥后在管子的末端盖上盖子，以防止水分进入。正式装载金粉溶液之前，同样需要先打开氮气，并将流量调节至0.3–0.4LPM，让氮气流过管子至少15分钟，确保没有水分干扰。 所以，你需要在正式制弹之前，别忘了先把管子养好! 一切准备就绪后，终于可以制弹了!不过，先别着急动手，我们还有很多数学问题需要先计算。 首先，因为需要向样品管里灌金粉溶液，所以我们需要先计算我们需要多少微载体装载量(MLQ)。 对于多数情况来说，为每个目标提供0.5毫克金粉是一个起点。1毫升悬浮液可以填充8.5英寸长的管子，一发子弹需要0.5英寸长的管子，每30英寸长的管子可装满约25英寸(3.0毫升)的DNA/金粉悬浮液(每端会留有一个空隙)。为了给每个靶点提供0.5 mg微载体(MLQ=0.5)，需要将DNA/微载体样品重新悬浮在8.5 mg金粉/ml乙醇中。一根25英寸长的管子需要25毫克的金粉再悬浮在3毫升的乙醇中。 具体如何制备金粉质粒混合悬浮液的步骤就不赘述了，下面继续讲样品管制备站的使用。 首先准备一段29–30英寸(约75厘米)的Tefzel管子，将其中一端连接到注射器适配软管上。重新反复震荡金粉混合液，确保金粉重新在溶液中悬浮起来，这时候，快速将Tefzel管子一端插入盛装金粉混合液的试管中，抽取大约22–24英寸(约58 cm)长度的液体，也就是距离上端留有6-8英寸(~17 cm)的空间(注意不要掺入气泡，也就是说，不要一边震荡一边吸，也不要尝试将全部金粉混合液从试管里吸出来)。然后将Tefzel管子从试管里拔出来，再抽2–3英寸 (~6 cm)的空气进去，这样保证两端都有一段空气缓冲。注意此时应当立即将管子端平，从管子外部擦去多余的金粉溶液，然后将管子轻轻地插入到样品管制备站的转轴里面。 因为这其中管子长度方面，很多是需要用记号笔配合目测来完成，因此经验很重要，很多环节无法精确控制。 此时第一阶段告于段落，静置，让金粉从管道的悬浮液中，垂直方向沉降10分钟，让金粉和乙醇溶液分离。 之后，利用你之前练成的手法，以0.5–1.0英寸/秒的速度匀速小心地将乙醇吸出来。如果此时发现乙醇中还带出来了很多金粉，建议重新来过，同样的条件下，试试多沉降一段时间再抽。乙醇吸出来之后，马上打开样品管制备站开关，让中轴开始旋转起来，这样可以让金粉均匀涂抹于管内壁。让金粉在管道内部旋转1分钟。 最后一步，打开氮气，调节至0.35–0.4 LPM流量，一边旋转一边通氮气干燥，持续5分钟。 关闭样品管制备站电源开关，关闭氮气，取出镀金了的管子，检查管子上是否已经均匀镀上了金粉，确保没有未被覆盖的区域，没有结块。最后使用配套的切段装置，将管子切成0.5英寸的小段子弹，立即使用或冷冻保存起来。 Helios基因枪的制弹流程之复杂，被新人称为噩梦，因为其中涉及的环节太多，而且最终任何一个环节的操作失误，都有可能会对最后轰击效果产生间接或者直接的影响。如果想制备好一发Helios子弹，不仅需要对制弹的各个环节的原理，理解到位，同时，手法需要熟练而快速。 下面再看Helios基因枪的应用范围。 Helios基因枪虽然是设计给小动物实验使用的产品，但是因为在GDS-80基因枪上市之前，并没有专门用于植物转化的手持式基因枪转化设备。于是有急需活体植物转化的植物实验室，也迫不及待地买来这个动物基因枪，用在了活体植物上面，比如轰击芽尖分生组织或烟草叶片。 但是活体植物样本，真的受得了这种轰击压力吗?在《Inoculation of Viral RNA and cDNA to Potato and Tobacco Plants Using the Helios Gene Gun》这篇报告中，在谈到Helios基因枪轰击压力与轰击距离的关系时，记录了Helios基因枪在轰击烟草叶片时，150或200psi压力下距离0 cm时可以正常完成转化，但是图中可以看出，在轰击中心区域有大量 细胞死亡。而在更高的250或300psi下，叶片会被撕碎。在80-100psi的压力下，轰击区域没有受到伤害，但也没有发现任何成功感染的叶片。 靠震波推动粒子加速的基因枪投递方式，应用到便携式基因枪时，一方面复杂的制弹工艺让使用门槛大大提高，操作效率难以提升，另一方面，高压震波对样品伤害大，限制了转化效率，同时由于震波的干扰，也让粒子的加速能力受到了限制。 英国剑桥大学MRC神经科学实验室O’Brien教授，最早意识到了震波可能是影响手持式基因枪投递效率的技术瓶颈所在。针对这个问题，O’Brien教授着手开展了有关低压基因枪管结构的改良工作。 MRC实验室基于Helios基因枪的主机，抛弃了原有的枪管，自主研发设计了一款改良的低压基因枪管。这款枪管的原理有点像手枪的消音器，也就是在原来枪管的外面延伸出来一段减震的枪管，减震枪管的管壁上被打出了很多小孔，来减少震波干扰。 在《Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro Biolistic transfection of organotypic neuronal tissue》这份报告中，MRC实验室选取了4个测试方向，来全面衡量改良后枪管的实际投递能力。这4个方向分别是，基因枪的轰击密度、基因枪轰击的穿透深度、基因枪轰击样本细胞后样本细胞的死亡率、以及最终表达效率。 实际测试中发现，在降低了震波干扰之后，枪管完全可以用更低的压力轰击投递，并且达到更高的轰击密度，更好的穿透能力，更低的细胞死亡率，以及更好的表达效率。 这个最早设计的低压基因枪管，证明了如果我们可以减少震波干扰，基因枪可以用很低的轰击压力，让粒子投递的效率提高，并且样本的伤害会减少，最终得到更高的表达效率。但是因为这种枪管是基于Helios主机的改良，沿用的依然是Helios的制弹方式，整体商业化价值有限，最后并没有推向市场。 真正商业化的低压手持式基因枪，是WEALTEC公司的第三代低压手持式GDS-80基因枪。 刚刚我们讨论了，如果想要用更低的压力，达到更好的微粒加速效果，枪管的设计是核心要素。GDS-80基因枪管采用了拉瓦尔喷管结构，也就是我们经常见到的火箭喷嘴结构设计。这种结构利用的是空气动力学原理中，亚音速状态下，气体流速会随着管道横截面积缩小而越来越快，而达到超音速时，气体流速反而会随着管道横截面积的扩大，而越来越快。GDS-80枪管的加样孔设在了拉瓦尔喷管的最窄处，因此当氦气冲过枪管时，枪管加样孔处的金粉子弹溶液，会被经过的氦气气流，以超音速的速度，完全喷射出枪管。枪管内壁经过精密镜面加工，可以保证每次轰击都能几乎100%地将所有样品完全喷射出枪管。 这种设计的好处是显而易见的，因为金粉质粒混合溶液可以直接加样到枪管的加样孔，在溶液状态下，直接进行轰击，也就意味着，GDS-80不仅不需要额外的样品管制备站这种专门的制子弹装置，而且，这也让这款产品成为了目前唯一一款可以直接投递转化Naked-DNA的动物用基因枪。因为动物细胞没有细胞壁保护，而且GDS-80的轰击原理决定了这款基因枪，可以直接喷射溶液进行轰击!《Noncarrier naked antigen-specific DNA vaccine generates potent antigen-specific immunologic responses and antitumor effects》中，Chen Cad 等人比较了裸 DNA 疫苗和金粒包裹的 DNA 疫苗分别通过低压基因枪 GDS-80 和高压基因枪转运时在体内产生的免疫效果。结果显示: 在鼠体内，裸 CRT/E7 DNA 疫苗导致更强烈的免疫反应，大幅度的 E7 特异性 CD8 + T 细胞前体和 E7 特异性抗体有所增加; 裸 CRT/E7 DNA 疫苗产生强大的抗皮下的 E7 表达肿瘤和抗 E7 表达前的转移性肺癌的抗肿瘤效果; 此外，裸 CRT/E7 DNA 疫苗免疫的鼠同用金珠包裹的 CRT/E7 DNA 疫苗免疫的鼠相比在皮肤表面的烧伤影响明显减少。实验最后得出: 裸 CRT/E7DNA 疫苗通过低压基因枪转运，同传统的金珠包裹的 DNA 疫苗相比，能产生相似强大的免疫应答和有效的抗肿瘤效果，且更方便，并具有更小的副作用。 为什么这种喷射式的基因枪粒子传递，转化效果会比震波式的传递效果要好?因为基因枪投递本质上来说，是一种散弹射击的原理。当我们用基因枪进行轰击时，要知道，绝大多数子弹是并不能完成转化的。有很多子弹根本就没有打中细胞，直接就留在细胞间质液中了;还有很多子弹，因为速度很快，虽然打到了细胞，但是直接穿过了细胞，并没有留在细胞内部;少数命中细胞，并且恰好留在了细胞内部的子弹，有的细胞已经在轰击中“牺牲”了，又有很多子弹因为没有落在细胞内部合适的位置，而没有完成转化。最后实际上，只有很小一部分的质粒子弹，通过基因枪传递成功完成转化，并在细胞中表达出来。 这就是为什么基因枪的转化效率，除了粒子的加速度以外，和轰击压力、轰击密度同样密切相关。更高效的粒子加速，可以让基因枪投递到更深的距离，但与此同时，去掉多余震波干扰的较低轰击压力，可以大大降低细胞的死亡率，提高表达效率。轰击密度代表了单位面积内，更大量的子弹“火力覆盖”，GDS-80基因枪的枪管内部结构，决定了每次轰击都可以让全部金粉溶液几乎100%完全被投递出枪管，相比使用PVP溶剂将金粉溶液粘附在塑料管壁，并通过高压震波从管壁将金粉吹下来的方式，有效被打出的子弹数量，也就是轰击密度，大大被提高。 最后，不得不提的商业授权问题。由于Helios以及PDS-1000基因枪使用的是Biolistic基因枪法，这项方法专利权归杜邦公司所有，实验室购买该设备，仅取得了实验室科研使用的权力，而并没有使用该设备做商业转化的权力。因此，如果使用Helios基因枪产生商业转化成果，需要向所对应的专利权受益人分享至少30%的专利使用费用。正式的专利使用声明原文翻译如下： “Bio-Rad公司销售的Biolistic仪器(PDS-1000/He系统或者Helios基因枪系统仅供研究使用。研究目的包括以探索并揭示与事实相关信息的探究与实验，不包括以下定义的商业用途。任何转让、赠与、抵押、租赁或委派这款Biolistic仪器，或在这之下获取研究许可都是被禁止的。这份协议同时对Biolistic仪器的操作演示具有约束力。在此份协议下，如果哺乳动物应用方面没有从Chiron Vaccines取得书面许可，其他应用方面没有从E. I. du Pont de Nemours and Co.取得许可的情况下，任何通过使用biolistic方法或仪器而进行的商业用途都 将构成对一项或多项专利的侵权。此协议下定义的商业用途包括通过生产、使用或转让biolistic仪器并从中获利，或使用此设备生产商用产品并包括这些商用产品所产生的生物材料或后代。” 正常的销售流程中，Biorad公司要求将一份商业专利权声明文件签署并传真或邮寄回传至美国总部才能发货。但由于国内市场秩序较为混乱，而且知识产权问题在国内执法力度一直不强，很多用户根本不知道有这样一个法律问题的遗留。这实质上是给中国很多科研单位，无形中挖了一个法律合规方面的坑。因此，在签订采购合同之前，请务必要代理商找伯乐厂商出具一份允许商业授权的文件，或确保Helios基因枪商用，不会出现第三方机构追究专利使用费的文件，这样才能避免未来出现的合规性纠纷。 而GDS-80基因枪的整个原理并不涉及Biolistic粒子传递的原理，是重新设计的拉瓦尔喷管式的粒子加速原理，因此GDS-80基因枪不涉及Biolistic方法专利权问题，并且WEALTEC威泰克公司对于客户成果的商业转化，是一种积极支持的态度，认为这种商业转化对于这项新技术的推广有益无害。 好了，上面这些内容就是我个人这些年来，对基因枪这个产品实际使用操作、调研，以及和各厂商业务人员以及应用工程师接触交流后的一些心得体会，记录下来也是对自己思路的一个整理，同时，也希望我的经验可以帮助更多希望了解和计划采购这个设备的单位，节省一些时间，少走一些弯路。 |
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